SPEKTROFOTOMETER

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu objek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan.

Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu 

1. spektrofotometer single-beam. Pada jenis ini, cahaya hanya melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai absorbansi dari larutan yang dimasukan.
2. spektrofotometer double-beam. pada jenis ini, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan dengan larutan yang diinginkan dalam satu kali proses yang sama.

Pada dasarnya dengan adanya chopper yang akan membagi sinar menjadi dua, di mana salah satu melewati blanko (disebut juga reference beam) dan yang lainnya melewati larutan (disebut juga sample beam). Dari kedua jenis spektrofotometer tersebut, spektrofotometer double-beam memiliki keunggulan lebih dibanding single-beam, karena nilai absorbansi larutannya telah mengalami pengurangan terhadap nilai absorbansi blanko. Selain itu, pada single-beam, ditemukan juga beberapa kelemahan seperti perubahan intensitas cahaya akibat fluktuasi voltase.

Spektrofotometer merupakan suatu alat yang dilengkapi dengan sumber cahaya (gelombang elektromagnetik), baik cahaya UV (ultra-violet) atau pun cahaya nampak (visible). Alat ini dapat membaca dan mengukur kepekatan warna dari sampel tertentu dengan panjang gelombang tertentu pula. Alat ini digunakan untuk mengukur konsentrasi beberapa molekul seperti DNA/ RNA (UV light, 260 nm), protein (UV, 280 nm), kultur sel bakteri, ragi/ yeast (Vis light, 600 nm), dan lain-lain. Sinar UV digunakan untuk mengukur bahan (larutan) yang terbaca dengan panjang gelombang di bawah 400 nano meter (nm). Sedangkan visible light bisa digunakan untuk mengukur bahan dengan panjang gelombang 400-700 nm. Penyerapan sinar UV dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan, penyerapan oleh transisi elektron d dan f dari molekul kompleks, dan penyerapan oleh perpindahan muatan.

Keuntungan utama metode Spektrofotometer adalah bahwa metode ini memberikan cara sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil. Selain itu, hasil yang diperoleh cukup akurat, dimana angka yang terbaca langsung dicatat oleh detector dan tercetak dalam bentuk angka digital ataupun grafik yang sudah diregresikan Secara sederhana instrument spektrofotometeri yang disebut spektrofotometer terdiri dari :

Sumber cahaya – monokromatis – sel sampel – detector - read out

Fungsi dari masing-masing bagian tersebut adalah: 

1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang.
2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monokromatis. 
3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel
4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. 

Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detector.

A.    PRINSIP KERJA

Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan dipantulkan, sebagian diserap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel.

Prisinp kerja dari spektrofotometer dapat di gambarkan sebagai berikut :

Sinar berasal dari dua lampu yang berbeda, yaitu lampu wolfram untuk sinar Visible (sinar tampak = 38 – 780nm) dan lampu deuterium untuk sinar Ultra Violet (180-380nm) pada video lampu yang besar. Pilih panjang gelombang yang diinginkan/diperlukan. Kuvet, ada dua karena alat yang dipakai tipe double beam, disanalah kita menyimpan sample dan yang satu lagi untuk blanko. Detektor atau pembaca cahaya yang diteruskan oleh sampel, disini terjadi pengubahan data sinar menjadi angka yang akan ditampilkan pada reader.

Yang harus dihindari adanya cahaya yang masuk ke dalam alat, biasanya pada saat menutup tenpat kuvet, karena bila ada cahaya lain otomatis jumlah cahaya yang diukur menjadi bertambah.

B.     CARA PENGOPERASIAN

1.      Buka plastik pelindung alat dan nyalakan mesin dengan menekan tombol ‘power’ di bagian belakang mesin (tombol di sebelah kiri bawah)

2.      Tunggu hingga 30 menit untuk memanaskan mesin sebelum dilakukan pengukuran sampel.

3.      Tekan tombol A/T/C, pilih absorbance (A).

4.      Bersihkan cuvet dengan aquades, tiriskan dengan tisu hingga bagian dalam cuvet tidak mengandung aquades lagi.

5.      Ukur absorbansi blanko dengan memasukkan larutan blanko ke dalam cuvet (volume minimal hingga ¾ dari tinggi cuvet).

6.      Bersihkan bagian luar cuvet yang transparan dari debu dan bekas jari tangan.

7.      Masukkan cuvet ke dalam cell holder pada sample chamber. Cuvet harus diletakkan hingga sampai dasar cell.

8.      Tutup sample chamber

9.      Tekan tombol untuk mengatur blanko pada konsentrasi 0

10.  Pilih panjang gelombang yang akan digunakan untuk mengukur sampel dengan menekan tombol 

11.  Bersikan cuvet seperti pada metode no. 4

12.  Siapkan sampel yang akan diukur, pastikan sampel homogen sebelum memasukkan ke dalam cuvet.

13.  Masukkan sampel ke dalam cuvet hingga volume minimal ¾ dari tinggi cuvet.

14.  Pastikan bagian luar cuvet besih dari debu dan bekas jari tangan.

15.  Masukkan cuvet ke dalam cell holder, tutup sample chamber

16.  Baca absorbance-nya

17.  Ambil sampel dari cuvet, bersihkan, dan ganti dengan sampel baru.

18.  Jika pengukuran semua sampel sudah selesai, matikan mesin, bersihkan cuvet dan tiriskan. Tutup kembali mesin dengan plastik.

C.     CARA PERAWATAN

Cara Perawatan dan Penyimpanan Alat :

1.      Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit.

2.      Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung, karena cahaya dari matahari akan dapat mengganggu pengukuran.

3.      Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang suhunya stabil dan diatas meja yang permanen.

4.      Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas sampel.

5.      Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering.

6.      Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur.

D.    CARA PENANGANAN TROUBLESHOOTING

Penyebab kesalahan sistematik yang sering terjadi dalam analisis menggunakan spektrofotometer adalah:

1.     Serapan oleh pelarut

Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi matrik selain komponen yang akan dianalisis.

2.     Serapan oleh kuvet

Kuvet yang biasa digunakan adalah dari bahan gelas atau kuarsa. Dibandingkan dengan kuvet dari bahan gelas, kuvet kuarsa memberikan kualitas yang lebih baik, namun tentu saja harganya jauh lebih mahal. Serapan oleh kuvet ini diatasi dengan penggunaan jenis, ukuran, dan bahan kuvet yang sama untuk tempat blangko dan sampel.

3.  Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan. (melalui pengenceran atau pemekatan).

DOWNLOAD FILENYA DISINI GAN

Share this post